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Nature Medicine:视网膜的干细胞修复,走向光明还是永堕黑暗?

撰文:步步先生

来源:干细胞者说



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全世界大约有4300万人失明,还有2.95亿人处于中度至重度视力障碍的困扰。失明是21世纪全球健康的一个重要挑战。现代社会,除了外伤,失明的主要原因是神经退行性导致的失明(包括老年性黄斑变性<AMD>、视网膜色素变性<RP>、青光眼)。随着医学的进步,各种治疗方法(如维生素D3疗法)已经开发出来,但逆转视力下降仍然是一个难以实现的目标。

过去十年中,干细胞技术和视网膜再生医学的飞速发展,使得眼睛里各种类型的细胞都可以从多能干细胞体外产生。近期,国际顶级期刊 Nature Medicine 杂志上发表一篇题为“Regenerative and restorative medicine for eye diseases”的综述文章。今天,我们试着解读一下。


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视觉的恢复和再生医学

失明的原因全球分布各不相同,在发达国家,大多数失明是由视网膜中特定细胞的退化造成的,包括视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器和视网膜神经节细胞。在过去的十年里,随着视网膜再生医学的进展,这些细胞类型都可通过干细胞技术从体外制备。

在这篇综述里,作者回顾了用于以视力恢复为目标的退行性疾病的细胞替代再生研究进展。首先,作者讨论了RPE移植的临床试验和其他类型细胞临床前研究的前景,回顾了使用内源性祖细胞原位修复视网膜变性的进展。最后,作者概述了关于人工眼视觉恢复的一个进展(包括先进的光伏器件、基于视蛋白的基因治疗和小分子光开关)



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视网膜的细胞替代疗法

目前,视网膜再生医学的替代疗法细胞种类包括:视网膜色素上皮细胞、视网膜前体细胞、光感受器、视网膜神经节细胞

图1. 替代疗法的细胞来源

外源性细胞来源:包括从视网膜类器官获得的细胞,从ESC或iPSC分化获得的细胞(如RPE等)。内源性细胞来源主要是Müller胶质细胞,可转分化为视网膜前体细胞,进一步分化为成熟的光感受器、神经节细胞和中间神经元。

▉ 视网膜色素上皮(RPE)移植
人类的视觉始于视网膜,由视杆或视锥分子中的11-顺式视黄醛吸收光子。全反式视黄醛必须重新异构化为11-顺式视黄醛才可吸收光子,这一功能主要在视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium,RPE)中进行。当萎缩视网膜黄斑变性或干性视网膜病发生时,会造成RPE丧失,导致光感受器功能障碍,最终变性,严重甚至失明。

图2. 视觉恢复路径(细胞替代,基因治疗,光电修复)

视网膜色素上皮是一个平铺的六边形单层细胞,每平方毫米约有4000个双细胞核的色素细胞。2004年,人们发现可以从人类多能干细胞中分化获得RPE样细胞。临床前研究表明,多能干细胞衍生的RPE细胞在移植后可以存活和发挥功能,并减缓感光细胞的死亡

目前,诸多人体临床试验正在进行,取得了一定的研究进展(表1)。这些早期临床试验的成功,凸显了再生医学具有恢复视力的潜力,并且为视网膜细胞替代治疗提供了路线图。

表1.正在进行和完成的视力恢复临床试验

▉ 视网膜前体细胞移植

多能干细胞来源的视网膜祖细胞,表达一些早期的泛光感受器分子(如CRX和恢复蛋白),并可进一步分化为视网膜光感受器。在动物模型中,研究者将视网膜前体细胞制剂注射至视网膜下方,细胞以低密度分化为锥体光感受器。然而,一些使动物研究表明:动物死后,视网膜组织学上存在显著的解剖结构紊乱。人类临床试验也正在进行中。在一项1/2a期人体临床试验,21名受试者接受玻璃体内注射人视网膜前体细胞。数据结果显示,治疗相对安全,接受相对高剂量细胞的患者视力得到改善
▉ 光感受器移植
视网膜前体细胞或RPE细胞的移植,可以用来支持具有完整的杆状和锥状光感受器的视网膜区域。在许多细胞损伤的情况下,需要更换光感受器。在一项动物实验中,研究者将人胎儿来源的视网膜组织移植到大鼠(视网膜变性免疫缺陷动物模型)体内,结果数据显示:光感受器明显成熟和视网膜中间神经元开始发育,这说明退化视网膜的微环境中也可发生视网膜相关细胞成熟

视网膜“类器官”的出现,提供了视网膜光感受器的移植来源。临床前研究表明,光感受器前体已经成功移植到视网膜变性动物模型中,并且可以迁移到正确的位置,表达视蛋白光色素,并延伸神经突起。这些都是功能恢复的必要先决条件。


尽管临床前研究令人鼓舞,但光感受器替代治疗必须克服两道障碍,才能进入人体临床试验。

第一个挑战:必须要将移植的光感受器整合到现有的神经回路中光感受器突触是逐步发育形成的。光感受器突触形成,第一步是水平细胞突起的内陷;第二步是几天后插入双极神经元突起形成突触三联体。新形成的光感受器,最后是否能在光感受器缺失的视网膜外丛状层,与水平和双极神经突起三者之间,形成功能性突触三联体尚不清楚。

第二个挑战:必须要形成具有支持光转导所必需的功能性RPE接触的光感受器外段。在大多数退行性疾病状态下,光感受器和RPE都会退化,需要两种类型细胞的共同移植。
视网膜神经节细胞替代术
视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cell ,RGC)是唯一能将信号从视网膜发送到大脑的神经元。RGC也可以从人类多能干细胞中分化获得。

RGC虽然在类器官培养中不能长期存,但可在细胞死亡前收集,并在移植前富集,也算一个重要的细胞来源。研究者将视网膜前体细胞移植到物模型视网膜下,形成的轴突主要迁移到视神经和大脑,这表明RGC再生是可行的。

尽管如此,视网膜神经节细胞替代治疗所面临的挑战更是困难重重。首先,移植的细胞必须归位(到达视网膜内的特定位置)并组合(与视网膜中的其他神经元形成突触以形成回路)。其次,移植的细胞需要再生轴突,并延伸到视觉感知所需的中枢神经系统靶点,主要是外侧膝状体。然而,这并没有得到证实。此外,视觉空间的重建依赖于视网膜神经节细胞的空间组织轴突投射,形成视神经位图。迄今为止,尚未开始RGC替代的人体临床试验。


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内源性细胞修复路径的激活
视网膜再生的理想方法不是细胞替代治疗,而是要激活受损组织中潜在的修复途径,比如激活内源性干细胞

在鱼类动物模型中,视网膜的放射状胶质细胞(即Müller细胞)可以去分化为视网膜前体,并可恢复因损伤而丢失的视网膜神经元。相反,哺乳动物模型视网膜损伤会导致 Müller 胶质细胞增生的损伤反应,但不会恢复丢失的神经元。

Müller胶质细胞转分化,可以实现人类视网膜和视神经的再生途径。例如,通过基因疗法表达某些因子,则可将Müller胶质细胞转分化为视网膜前体细胞。在小鼠模型中,Müller胶质细胞表达转录因子Ascl1,同时抑制组蛋白脱乙酰酶,使Müller胶质细胞在受损视网膜中去分化为视网膜前体细胞。在小鼠模型中,在无视网膜损伤的情况下,表达转录因子Atoh7和Ascl1,将Müller胶质细胞重编程为神经前体细胞。

虽然,使用Müller胶质细胞转分化修复视网膜损伤的程度尚未确定。可以看出,这是一种很有前景的视网膜再生疗法,并有望在未来得到应用。


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恢复视力的其他方式

▉ 光电修复术

光电修复设备是利用电流将视觉信息转化为对视网膜细胞刺激的一种小设备,旨在恢复具有光感受器功能但具有完整视神经患者的视觉功能(如老年性黄斑变性和视网膜色素变性)

通常,光电修复设备放置在视网膜下方和视网膜前方。最新的光电修复设备是直接光伏的,不需要有线电源;可利用植入物的红外激活,从而同时实现“自然”和修复功能。在早期临床试验中,光电修复设备显示出了良好的前景。虽然,可能仅限于刺激中央视野,毕竟植入视网膜下的设备尺寸有实际限制,太大个也放不下。

▉ 基因治疗术

2017年,美国 FDA 批准了全球第一个用于神经疾病治疗的基因疗法,通过AAV将RPE65光异构酶基因传递到视网膜。遗憾的是,目前的基因疗法只针对单个基因。与视网膜色素变性有关的基因超过60个,具有很大的挑战性。眼内基因治疗可能还有其他局限性,但对治疗遗传性视网膜疾病也是一个希望。

目前,恢复视觉的基因疗法有两种策略。第一种策略:表达相关营养因子(这些营养因子提供生长和生存信号,其表达可能减缓退化过程)的基因疗法。这些因子包括睫状神经营养因子(CNTF)、色素上皮源性因子(PEDF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和视锥细胞生长因子(RdCVF)第二种策略:用于视觉恢复的基因疗法(即“光遗传学”)。首先,通过病毒载体,将光转导视蛋白导入双极/视网膜神经节细胞。然后,在视网膜下或玻璃体内进行注射。最后,视蛋白在视网膜内神经元中表达,并直接对光反应。



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挑战和机遇

在过去十年中,视网膜疾病的细胞替代治疗取得了巨大进展。人类临床试验中,在视网膜色素上皮(RPE)细胞和神经前体细胞移植前,都要实施全身免疫抑制剂,目的是避免移植后机体的排斥反应。值得注意的是,实施全身免疫抑制对患者具有长期风险。

针对降低或避免使用全身免疫抑制剂的问题,目前有两种策略:第一种策略:使用患者自身iPSC衍生的RPE细胞等,这样免疫排斥比较弱。不过,如果定制个性化视网膜“类器官”,还是要考虑免疫排斥的问题。第二种策略:开发HLA经基因编辑的iPSC。令人激动的是,在体外实验中,iPSC衍生的视网膜神经节细胞(RGC),可优先迁移到其天然脑靶点的外植体。

所有视觉恢复方法都面临着最后一道关卡——“编码”问题视网膜执行图像处理线路,包括方向、运动、对比度和颜色的编码)。至少有30种类型的RGC将这些信息编码为特定的细胞放电模式,包括ON、OFF和ON-OFF模式。视觉恢复方法可以用新编码取代原生编码(光遗传学可以将“OFF”细胞放电模式转换为“ON”)


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文末小结
就在十年前,退行性视网膜疾病的视觉功能恢复似乎是一个大胆的、可能无法实现的目标。随着再生医学、基因治疗和光电修复术的飞速发展,用不了多少年,这个目标很快可以变成现实,科学家对此充满了信心。

当前,在美国在中国在日本,多能干细胞衍生的细胞移植进行视网膜色素上皮(RPE)细胞替代治疗的临床试验如火如荼,并将开展光感受器(RGC)替代治疗的临床试验。虽然RGC移植面临的挑战更大,但在这一领域也取得了重大进展。未来十年,多种视觉恢复技术很可能将进入临床应用。

就国内而言,开展视网膜再生或修复方面的细胞治疗临床研究,主要在北京同仁医院,郑州大学第一附属医院和陆军军医大学西南医院。采用的细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞和胎儿来源的RPE细胞。基因疗法,进入新药临床试验(IND)默许阶段的主要是纽福斯生物研发的NR082眼用注射液,适应症是治疗Leber遗传性视神经病变(G11778A),国内首个获得临床试验许可的眼科体内基因治疗药物。最后说一句,本来想做个全球开展细胞疗法和基因疗法的统计表,但昨晚查了查资料,觉得工作量太大了,以后再弄吧。

细胞疗法和基因疗法前景虽然美好,但在实际开发中,却是挑战重重。如何突出重围,最终惠及广大患者,是大家都要面临的考验。然而,通往成功的道路上也不乏机遇,但机会往往只会留给有准备的人。

参考文献:

Regenerative and restorative medicine for eye disease, Nature Medicine, 28 (2022) 1149-1156.https://doi.org/10.1038/s41591-022-01862-8


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